Nuôi cấy mô tế bào còn được gọi là nuôi dưỡng ngoài cơ thể. Nó được nuôi dưỡng vô trùng từ các cơ quan của cây như là lá, hoa, quả, rễ và kể cả tế bào. Đối với hoa lan, người ta có thể dùng thân, rễ, củ, các lát cắt để nuôi dưỡng thành cây giống. Phương pháp này vừa nhanh vừa không phụ thuộc vào thời tiết, có thể sản xuất quanh năm, tiết kiệm đất, lao động…Hiện nay ngoài các trường Đại học và các Viện nghiên cứu, các cơ sở chuyên nhân giống hoa lan, các doanh nghiệp cũng tích cực nghiên cứu hệ thống nuôi cấy mô phù hợp với điều kiện gia đình và đạt hiệu quả kinh tế cao.
– Xây dựng hệ thống nuôi cấy mô
Diện tích phòng cấy mô vô trùng không quá lớn chỉ cần đặt được một tủ cấy mô vô trùng và có chỗ thao tác là được. Trong phòng vô trùng có một bảng đèn tử ngoại kết hợp với phun diệt khuẩn và dùng acid sunfuric đậm đặc pha thêm một ít thuốc tím để phun theo định kỳ. Tủ vô trùng có thể tự làm và cũng có thể mua tại những nơi chuyên sản xuất tủ nuôi cấy mô thực vật hoặc tủ vô trùng của y tế.
Để vô trùng môi trường và dụng cụ cần có nồi áp suất gia dụng (nếu có nồi hấp của y tế là tốt nhất), bếp điện (nồi vi sóng). Ngoài ra còn cần các dụng cụ sau:
– Một cân phân tích (1OOg)
– Một nồi Inốc hoặc nồi nhôm (1-2 lít)
– Một máy ép hoa quả
– Đèn cồn, kéo y tế, dao mổ, đũa cấy mô, bình tam giác, bình đong, bình chứa dung dịch, hộp petri, ống hút, ống nhỏ giọt, bông, găng tay cao su và giấy lọc…
– Nếu có điều kiện có thể mua thêm tủ sấy, máy lắc…
Trong quá trình thao tác, tất cả các dụng cụ chịu được nhiệt độ cao đều phải khử trùng bằng nồi áp suất. Nồi áp suất gia dụng không có đồng hồ đo, khi diệt khuẩn chưa đậy nấp ngay mà đun cho nước sôi sủi bọt, hãy đậy nắp để khử trùng trong vòng 20-25 phút, sau đó để nguội tự nhiên. Những dụng cụ không chịu nhiệt thì dùng hoá chất để khử trùng.
Ở một số nơi có thể tự chế tủ cấy mô vô trùng hoa lan, các phần chính như sau:
Tủ cấy mô vô trùng tuy đơn giản nhưng rất thực dụng, có thể làm bằng gỗ, gỗ dán, kính hoặc kính hữu cơ, to nhỏ tùy thuộc vào nhu cầu, thông thường rộng 60-70 cm sâu 40-45 cm, cao 50 cm, phía dưới đục 2 lỗ thao tác, bên ngoài có nắp. Như vậy có thể thò tay vào để thao tác vừa giảm được ô nhiễm, trên tủ có bóng đèn 25W và một bóng đèn cực tím 8-20W.
Phần dưới bên phải mặt sau và phía trên mặt trái, để lỗ thông hơi đường kính 10 cm dưới lỗ thông hơi xếp 5-6 lớp vải màn cho khí vào, trên lỗ xếp 2-3 lớp vải màn cho khí ra, để tiện cho không khí lưu thông. Bên phải trái có thể cho một phía để lắp cửa lùa để có thể đưa những dụng cụ vào ra dễ dàng. Trước khi sử dụng 2-10 tiếng có thể bỏ 2-4g thuốc tím vào trong lọ miệng rộng sau đó đổ 10-20ml phoocmon vào, tạo thành phản ứng, hơi phoocmon bốc lên sẽ có tác dụng khử trùng. Trước khi thao tác bỏ bình ra nếu phối hợp với bật bóng đèn cực tím sẽ có tác dụng vô trùng tốt hơn.
– Dung dịch cấy mô hoa lan thường dùng và cách pha chế
Dinh dưỡng cho nhân giống hoa lan nhanh thường dùng phương pháp pha chế của MS (Muzashige và Skooy, 1962); VW (Vacin và Went, 1949); BS (Gambozg 1968); White (1949). Nhân giống hoa lan trong gia đình nên dùng môi trường MS, tùy từng giai đoạn có pha thêm chất kích thích sinh trưởng với nồng độ khác nhau.
Phương pháp pha chế chất dinh dưỡng dùng trong nhân giống hoa lan:
Các hóa chất thông dụng trong nhân giống hoa lan gồm 5 loại đa lượng của dinh dưỡng MS (NH4NO3, KN02, CaCl2.2H2O, MgSO4.7H2O, H2PO4, thuốc tím, phoocmon, đường trắng, dầu quỳnh, cồn y tế, giấy lọc PH (PH 5,4-7.0), bột tẩy trắng đa dụng hoặc thuốc tẩy trắng, một số nguyên tố vi lượng của MS, phụ liệu hữu cơ và ít chất kích thích, được cân bằng cân phân tích, cũng có thể mua tại các viện nghiên cứu hoặc cơ sở chuyên nhân giống hoa lan dinh dưỡng pha sẵn để vào tủ lạnh dùng dần. Chất dinh dưỡng sau khi pha xong phải được khử trùng bằng nồi cao áp mới được sử dụng.
Đối với các cơ sở chuyên nhân giống hoa lan, để tăng hiệu quả cả quá trình phải thay 3-4 loại dinh dưỡng như loại dinh dưỡng cho thân phình to, loại cho thân giả phát triển, loại cho thân giả phân hóa nẩy mầm và loại cho ra rễ. Cũng có khi dùng thêm loại dinh dưỡng tăng sinh trưởng cho cây giống. Thường là các giống lan khác nhau, thích ứng với các loại dinh dưỡng nhân giống khác nhau. Nhưng bất luận loại nào, những thành phần chủ yếu vẫn là đạm, lân, kali, canxi, ma nhê, lưu huỳnh, sắt, Bo, Mg, Cu, Zn, Mo, Cl, I…. Về một số chất hữu cơ kích thích sinh trưởng, đường trắng. Đặc biệt là các chất kích thích sinh trưởng mặc dù nồng độ rất thấp nhưng rất quan trọng cho tái sinh chồi, rễ của các mô lan.
Trước hết phải pha dung dịch mẹ, tức là loại dung dịch hỗn hợp, nhiều thành phần dinh dưỡng, có thể pha một lần dùng nhiều lần. Thông thường các muối được hòa tan trước sau đó được hỗn hợp lại. Bội số của dung dịch tỷ lệ nghịch với liều dùng, dùng ít với hệ số pha loãng lớn (100-1.000 lần), dùng nhiều hệ số pha loãng hơn (10-20 lần). Nguyên tố vi lượng và đa lượng phải pha riêng sau mới hỗn hợp với nhau. Khi hỗn hợp cần tách ion dương, âm tránh xảy ra phản ứng hoá học dẫn đến kết tủa, thuốc của sắt phải pha riêng, có thể pha lẫn FeS04.7H20 5,57g với 7,54g Na2.EDTA trong 1000 ml nước, 1.000 ml dung dịch dinh dưỡng chỉ cần lấy 5 ml dung dịch mẹ để pha loãng. Các chất như acid glutamic, vitamin, kích thích sinh trưởng phải pha riêng tuỳ thuộc vào liều lượng để pha (10-100 mg). Một số chất kích thích không hoà tan trong nước như IAA, IBA, GA, NAA phải dùng cồn 95% làm dung môi, một số chất như 2,4 D phải dùng 1 mol NaH2O đề hoà tan, hoặc 6 – BA dung l mol NaCl để hòa tan, sau đó mới hoà loãng bằng nước. Nồng độ thường được biểu thị bằng mg/l, sau khi pha xong đưa vào tủ lạnh để bảo quản.
Khi đã có sẵn dung dịch mẹ, sẽ căn cứ vào loại dung dịch dùng cho cấy mô mà pha loãng, trước hết hãy lấy dung dịch của các nguyên tố đa lượng sau đó theo thứ tự pha thêm dung dịch vi lượng như sắt, acid glutamic, vitamin, chất kích thích sinh trưởng và các phụ gia khác, tiếp đó dùng nước cất pha đến 1/2 định lượng, pha thêm nước đường và dầu quỳnh, đun lên cho hoà tan rồi điều chỉnh pH sao cho phù hợp với yêu cầu, tiếp tục pha thêm nước cất đến thể tích định sẵn, cuối cùng đổ dụng cụ vào thùng chứa dung dịch dinh dưỡng dùng cho cấy mô và đun ở 98 apmosphe, nhiệt độ 121°c để khử trùng, đến khi nguội thì bỏ ra.
– Nuôi dưỡng mô
Nuôi dưỡng mô thông thường gồm 4 bước: Lấy mô vô trùng, hình thành thân tròn, cắt thân tròn thành nhiều mảnh, thân tròn phân hoá.
Nhân giống hoa lan nhanh có thể dùng cây con từ gieo hạt trong điều kiện vô trùng, đủ ra rễ chưa có lá để làm vật liệu nuôi cấy. Các mô được cất trong điều kiện vô trùng đưa vào dịch dinh dưỡng cho hình thành thân tròn, chủ yếu dung dịch dinh dưỡng này là: 0,5-1,0 mg/l, NAA + 0,1-l,0mg/l, 6-BA và 10% nước dừa.
Sau một thời gian nuôi dưỡng trong bóng tối sẽ hình thành thân tròn màu trắng, sau đó đưa ra nuôi dưỡng trong điều kiện ánh sáng yếu với nhiệt độ 25° thân tròn sẽ chuyển màu xanh. Thân hình tròn sẽ được chuyển vào dung dịch 1/2 MS + nước hoa quả hoặc MS 4-2 mg/l NAA + 1000 mg/l than hoạt tính hoặc MS + 2 mg/l NAA + 5% nước dừa + 2% than hoạt tính với nhiệt độ trong phòng 25 + (-) 1°c, ẩm độ 60-70%, ánh sáng 2.000 Lux, mầm sẽ phát triển nhanh.
Nhân giống hoa lan nhanh cũng có thể dùng mầm từ 7-8 cm dưới gốc của những cây sinh trưởng khỏe, đem rửa bằng xà phòng và phun bằng nước máy khoảng 10-15 phút cho sạch, sau đó trong điều kiện vô trùng cắt lấy nửa trên của mầm, bóc đi 1/2 lá bên ngoài, sát trùng qua bằng cồn 25°c rồi ngâm vào NaCl 10% khoảng 10 phút, lắc nhẹ làm tăng hiệu quả khử trùng, khi bỏ ra lập tức rửa bằng nước vô trùng. Bóc tiếp 2 -3 lá rồi đưa vào khử trùng 5 phút trong nước muối, lấy ra rửa bằng nước vô trùng và bóc đến lá cuối cùng.
Hình Cây lan được nhân giống bằng nuôi cây mô (Ảnh internet)
– Các bước tiến hành nuôi cấy mô tế bào hoa lan
1. Cắt lấy điểm sinh trưởng; 2. Đưa mẫu vào dung dịch cấy mô; 3. Nuôi dưỡng trong dung dịch; 4. Phân chia tế bào; 5. Cắt thành miếng nhỏ; 6. Hình thành thân hình cầu; 7. Tách thân hình cầu; 8. Nuôi dưỡng thân hình cầu phân hoá; 9. Hình thành nhóm cây con; 10. Tách cây con; 11. Nuôi dưỡng cây khỏe; 12. Đưa ra trồng; 13. Trồng vào chậu.
Sau đó lấy điểm sinh trưởng làm trung tâm cắt thành hình vuông chừng 0,3-0,4 cm, đưa vào nước muối ngâm 1 phút, bỏ ra rửa vài lần bằng nước vô trùng, dùng dao mổ cắt thành vài miếng, các miếng cắt lần lượt được cấy vào dung dịch MS + 0,1-0,2 mg/l NAA hoặc 1/2 dung dịch 6-BA 0,5 – 2 mg/l rồi đưa vào phòng nhiệt độ 24-25°C và ánh sáng tán xạ, cường độ ánh sáng khoảng 1.500-2.000 lux. Thời gian chiếu sáng khoảng 12 tiếng để tạo thân hình cầu. Như vậy sau khoảng 4-6 tuần mô sẽ hình thành nhiều thân hình cầu, nếu như cắt thân thành nhiều mảnh hoặc dùng máy ép bằng kính ép vỡ rồi lại cấy vào dung dịch, trong một thời gian ngắn sẽ hình thành nhiều thân hình cầu, hình thái và tỷ lệ hình thành thân hình cần phụ thuộc vào dung dịch nuôi dưỡng. Có giống hoa lan trên bề mặt phủ kín lông tơ màu trắng, có giống thưa hơn. Hình thái thân hình cầu ổn định thì sẽ dễ dàng nuôi dưỡng, chỉ cần đưa vào dung dịch 1/2 MS + nước rau quả thích hợp hoặc dinh dưỡng MS + 2 mg/l NAA + 1000 mg/l than hoạt tính, sau 1-2 tháng nuôi dưỡng sẽ hình thành nhiều thân hình cầu và sinh trưởng thành từng bụi. Có nhiều nghiên cứu cho thấy trong thời gian nhân giống hoa lan không nên pha chất kích thích sinh trưởng vào dung dịch hoặc cố gắng hạn chế làm thay thế bằng dịch hoa quả, thân hình cầu phân hóa thành mầm được thuận lợi, cây giống ít phát sinh biến dạng. Còn dùng chất phân chia tế bào không thỏa đáng, thân hình cầu phân chia không bình thường, có lúc không ra được mầm hoặc hình thành lá dày, cây không bình thường. Ngoài ra quá trình phân bào nồng độ ion không quá cao, vì dễ dẫn đến cây hoa lan phát triển không bình thường, Nếu có thể nên dùng dung dịch huyền phù để tăng tốc độ nhân giống hoa lan. Để tăng lượng không khí và thay đổi không khí trong dung dịch thông thường nên dùng máy lắc (60-120 lần/phút) hoặc máy quay (2 vòng/phút), thông thường dùng máy quay tốt hơn máy lắc. Khi cây hoa lan con cao 2-3 cm, có thể cắt và chuyển đến dung dịch 3/4 MS + dịch hoa quả + vi lượng dung dịch MS + nước rau quả để nuôi dưỡng từ 1 -3 tháng cây sẽ cao từ 10-15 cm có 3-4 lá, và 2-3 rễ có thể đem trồng.
– Trồng và chăm sóc hoa lan con từ phòng cấy mô
Cây được đem trồng trong điều kiện nhiệt độ phù hợp. Trước khi đưa ra trồng 2-3 ngày, mở nắp bình tam giác đựng cây giống làm cho cây thích nghi với môi trường tự nhiên rồi mới lấy ra. Nếu miệng bình rộng nên đổ vào một ít nước lắc nhẹ đế cho dung dịch tan đều rồi hãy cho nước sạch vào rửa, nếu miệng bình nhỏ sau khi đổ nước lắc nhẹ rồi dùng dây thép móc ra, tránh làm tổn thương rễ, nếu như cây to và nhiều rễ chỉ có cách đập vỡ bình để lấy cây (bọc bình và cây bằng miếng vải rồi dùng búa đập nhẹ, nhưng phải chú ý tránh làm hỏng cây và gây thương tích cho người). Cây hoa lan con được rửa bằng nước sạch, dùng chổi lông quét sạch những thứ bám vào cây, sau khi rửa nên dùng nước sạch dội qua cho sạch, nếu không cây dễ bị thối rữa. Cây con sau khi rửa sạch tiến hành phân loại to nhỏ và xếp lên giá có lót bằng giấy báo, có thể dùng thuốc diệt khuẩn phun phòng, chờ cho cây ráo nước mới đem trồng.
Cây hoa lan con được đưa vào chậu thông khí thoát nước tốt. Nên dùng rêu để làm giá thể, rêu được ngâm, rửa sạch, ép khô với độ ẩm nhất định và vô trùng. Trước khi đưa cây vào trồng, đáy chậu được phủ một lớp rêu dầy khoảng 1cm, rễ cây được cuốn bằng rêu, sau đó đặt vào chậu theo mật độ đã định, cần phân loại cây to nhỏ để dễ chăm sóc. Cây được chèn cho vững, không quá lỏng. Cây con lúc này rất yếu nên phải được đặt vào những nơi râm mát, thông thoáng, ánh sáng yếu, ẩm độ cao. Sau khi trồng hoa lan con, phun nước tưới ẩm cho cây và giá thể đủ ẩm. Tiếp đó mỗi ngày phun vài lần, không quá khô hoặc quá ẩm. Sau 7-10 ngày tăng dần lượng nước. Sau 2 tuần mỗi tuần phun 1 lần thuốc bảo vệ thực vật, khoảng 3 tuần sau cây hoa lan mọc rễ non. Khi đó có thể tăng dần ánh sáng và mỗi tuần phun phân qua lá một lần có thể phun bằng KH2PO4 0,1-0,2% khoảng 6-8 tháng khi cây cao 15 cm có thể tách trồng riêng rẽ mỗi chậu một cây. Thường dùng loại chậu có đường kính từ 8-9 cm, khi nào cây cao 60 cm chuyển sang chậu 12 cm. Sau một năm khi thân giả to mập và nhú mầm lại đổi sang chậu to đường kính 16-18 cm.